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重组蛋白纯化的基本策略

纯化问题所涉及的具体步骤最终取决于样品的性质。但也有共同可参考的阶段

捕获阶段:目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。

中度纯化阶段:目标是除去大多数大量杂质,如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。

精制阶段:除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。

分离方法的选择

根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法:


每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。

分辨率:由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说,当杂质和目标蛋白性质相似时,在纯化的zui后阶段分辨率是重要因素。

处理量:一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。

速度:在初纯化中是重要因素,此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。

回收率:随着纯化的进行渐趋重要,因为纯化产物的价值在增加。

在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表:


提示:

1、通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至zui少,以避免需要调节样品。*个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。

2、硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法,所以HIC是捕获阶段的理想方法。

3、GF很适宜在由浓缩效应的方法(IEX、HIC、AC)后使用,凝胶过滤对上样体积有限制,但不受缓冲液条件的影响。

4、在捕获阶段选择对目标蛋白具有zui高选择性或/和处理量的方法

5、如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下,可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。

6、只要目标蛋白耐受的情况下,可以考虑采用RPC方法用于精制阶段。

注:应该指出,三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的zui终用途。

文章分类: 产品知识
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